4.

Verfahren zur Stabilisierung der E-Rosetten mit Glutaraldehyd Fuchs, R., Becker, U. u. Eckstein, D. Folia Haematol. 105(1978), 370 - 375

Die zuerst von Coombs (7), Brain (4) und anderen Autoren (1,3,12) beobachtete rosettenförmige Anlagerung unsensibilisierter Schaferythrozyten an menschliche Lymphozyten hat sich als ein brauchbares Verfahren zum Nachweis thymusabhängiger Zellen erwiesen (5,10). Die Verbindung der Lymphozyten mit den Erythrozyten ist auf Grund eines nur punktförmigen Kontaktes sehr labil (2). Jondal (11) und Cone (6) nehmen an, daß die E-Rosettenbildung über einen von der Zelle selbst produzierten Rezeptor erfolgt, der von der Zellwand rasch abgegeben oder metabolisiert wird. Mit dem Verschwinden des Rezeptors wird die zelluläre Bindung des Lymphozyten mit den Erythrozyten entkoppelt und die Rosette zerfällt in ihre Einzelbestandteile. Die hieraus resultierende hohe Fragilität der E-Rosetten soll für die große Streubreite der Prozentzahlen rosettenbildender Zellen im Schrifttum verantwortlich sein (2,9,14). Im Rahmen präparativer Arbeiten zur Rasterelektronenmikroskopie erwies sich Glutaraldehyd als geeignetes Fixationsmittel, E-Rosetten formbeständig und ausstrichsfest zu machen. Im folgenden soll über unsere Erfahrungen mit der Glutaraldehydfixierung berichtet werden.

Material und Methode

Lymphozytenisolierung über den Dichtegradienten. Nach dreimaligen Waschen in PBS-Puffer, pH 7,4, Zellzahleinstellung auf 2 * 10\6, Lymphozyten ml. Vitalitätsprüfung mit (...) dreifacher Versuchsansatz: 0,125 ml gewaschene 5 %ige Schaferythrozytensuspension + 0,25 ml Lymphozytensuspension + 0,25 ml PBS-Puffer, pH 7,4, in dünnlumige Zentrifugenröhrchen pipettieren. Zentrifugieren für 5´ bei 1900 U/min. Unmittelbar nach dem Zentrifugieren Bestimmung der Sofortrosetten aus dem Röhrchen 1. Röhrchen 2 und 3 werden für 1 h bzw. 24 h in den Kühlschrank gestellt. Zur Rosettenzählung vor dem Resuspendieren etwa die Hälfte des zellfreien Überstandes mit der Pasteurpipette absaugen. 3 Tropfen 0,5 %igen Glutaralhedryd (FERAK-GmbH, West-Berlin) hinzugeben. Vorsichtig aufschütteln. Weiterbearbeitung für Feuchtpräparat nach 1 -2 min oder später, für Ausstriche nach 5 min. Die so fixierten Rosetten verändern ihre Form und ihre primäre vorhandene Zahl nicht mehr.

Auswertung

a)	Feuchtpräparat: 1 Tropfen der glutaraldehydfixierten Zellsuspension auf Objektträger bringen, mit Deckgläschen abdecken (Abb. 1). Die Verwendung eines Objektträgers an Stelle der üblicherweise benutzten Zählkammer hat den Vorteil, die Rosetten mit der Ölimmersionsvergrößerung betrachten zu können.
b)	Ausstrichpräparat: 1 Tropfen der Zellsuspension wie üblich auf Objektträger ausstreichen. Nach Lufttrocknung Pappenheim-Färbung (Abb. 2). Auszählen von je 200 Lymphozyten durch zwei Untersucher. Als Rosetten gelten Lymphozyten, die drei oder mehr Erythrozyten an der Oberfläche angelagert haben (8).

Ergebnisse

Der E-Rosettentest wurde bei 52 klinisch gesunden Personen mit der oben beschriebenen Technik durchgeführt. Die ermittelten Ergebnisse der Sofort- und der Spätrosetten wurde in Tab. 1 zusammengestellt. Dabei zeigte sich eine gute Übereinstimmung der Prozentzahlen in den Feucht- und Ausstrichpräparaten. Zur Überprüfung der Stabilität der fixierten E-Rosetten erfolte bei 12 weiteren gesunden Probanden eine Wiederholung der Rosettenzählung nach 24stündigen Stehenlassen im Kühlschrank. Aus der Tab. 2 geht hervor, daß signifikante Unterschiede weder zwischen den Ausstrich- und den Feuchtpräparaten noch zwischen den beiden Untersuchungszeitpunkten feststellbar waren. In drei Fällen ergab ein zusätzliche Zählung nach 96 Stunden ebenfalls keine relevanten Abweichungen von den primär gefundene Werten. Die höheren Prozentzahlen in der Gruppe der 12 Normalpersonen (Tab.2) gegenüber dem Kollektiv der Tab. 1 könnten auf den Fehler der kleinen Zahl zurückzuführen sein. Zur Frage des Einflusses der Umgebungstemperatur auf die Stabilität der fixierten E-Rosetten konnte festgestellt werden, daß es ohne Bedeutung war, ob der Testansatz bei Zimmer- oder Kühlschranktemperatur aufbewahrt wurde.

Tabelle 1 E-Rosetten im Feuchtpräparat und im Ausstrich bei 52 Normalpersonen

	Sofort-Rosetten	Spät-Rosetten
		1 h 4 °C	24 h 4°C
Feuchtpräparat	14,6 +/- 12,3 %	45,2 +/- 11,8 %	53,8 +/- 16,3 %
Ausstrich	18,6 +/- 10,3 %	42,7 +/- 13,4 %	51,5 +/- 14,9 %

Tabelle 2 E-Rosetten nach Fixierung mir Glutaraldehyd (...)

	Sofort-Rosetten	Spät-Rosetten
		1 h 4 °C	24 h 4°C
Feuchtpräparat	13,4 +/- 10,1 %	58,3 +/- 22,6 %	65,9 +/- 14,6 %
Nach 24 h *	17,8 +/- 13,6 %	57,3 +/- 17,7 %	70,2 +/- 11,1 %
Ausstrich	23,2 +/- 12,7 %	55,6 +/- 18,6 %	64,8 +/- 13,5 %
Nach 24 h *	26,3 +/- 14,0 %	53,8 +/- 16,0 %	66,3 +/- 14,5 %

* Nach 24stündiger Aufbewahrung der Zellsuspension im Kühlschrank

Diskussion

Die vorliegenden Untersuchungsergebnisse machen die Vorteile der technisch überaus einfachen Fixierung der E-Rosetten mit Glutaraldehyd im Vergleich zur nativen Präparationstechnik deutlich. Gleichzeitig verleiht die Einwirkung des Glutaraldehyds den Rosetten Ausstrichfestigkeit, die es gestattet, panoptisch färbbare Präparate herzustellen . Andere Verfahren zur Herstellung ausstrichsfähiger Rosetten, wie der Zusatz menschlichem Serums und Humanalbumin in verschiedenen Konzentrationen sowie das Einbrennen von Hühnereiweiß auf den Objektträgern hatten zu morphologisch schlechten Ergebnissen geführt. Die in unseren Untersuchungen nachgewiesene Identität der Ergebnisse der Feuchtpräparate und der Pappenheim-Ausstriche ermöglicht die alternative Anwendung beider Zählmethoden. Darüber hinaus erlaubt die Anfertigung haltbarer Präparate eine Archivierung der Untersuchungsergebnisse. Die von uns gefundenen Normalwerte stimmen mit der Mehrzahl der im Schrifttum mitgeteilten Ergebnisse überein (13,16,17). Niedrigere Prozentsätze anderer Autoren (9,12,18) haben ihre Ursache sehr wahrscheinlich in einer nicht optimalen Untersuchungstechnik. In der Literatur fanden wir eine Mitteilung von Schafer und Mitarb. (15), die mit einem in den Details etwas anderen Vorgehen ähnlich gut übereinstimmende Resultate von Frisch- und Ausstrichpräparaten glutaraldehydfixierter E-Rosetten beschrieben.

Zusammenfassung

Es wird eine technisch einfache Methode zur Fixierung von E-Rosetten dargestellt. Durch Einwirkung von 0,5 %igem Glutaraldehyd werden die an sich sehr fragilen E-Rosetten formbeständig und ausstrichfest. Vergleichende Untersuchungen an Frisch- und panoptisch gefärbten Präparaten zeigen eine gute Übereinstimmung der Ergebnisse. Die Vorteile der Methode liegen in der leichten Handhabung, der möglichen simultanen oder alternativen Anwendung zweier Auszählverfahren und der Möglichkeit zur Archivierung der Testergebnisse.

Schrifttum

(1) Bach, J. F.: Antigen-binding lymphocytes. Lancet 1 (1970) 565.
(2) Bentwich, Z., and H. G. Kunkel:Specific properties of human B and T lymphocytes and alterations in desease. Transplant. Rev. 16 (1973) 29.
(3) Bianco, C. V., Nussenzweig, W. H. Lay, and N. F. Mendes: Binding of sheep red blood cells to a large population of human lymphocytes. Nature 230 (1971) 351.
(4) Brain, P., J. Gornod, and W. A. Willert: Rosette formationby peripheral lymphocytes. Clin. Exp.Immunol. 6 (1970) 681.
(5) Cohnen, G., W. Augener, S. D. Douglas, E. König, and G. Brittinger: Surface markers for T and B lymphocytes in normals and patients with lymphoproliferative disorders. Boll. Ist. Sieroter. Milanese 53 (1974)
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(7) Coombs, R. R. A., B. W. Gruner, A.B. Wilson, G. Holm, and B. Lindgren: Rosette formation between human lymphocytes and sheep red cells not involving immunoglobulin receptors. Int. Arch. Allergy 39 (1970) 658.
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(11) Jondal., M., G. Holm, and H. Wigzell: Surface markers on human T and B lymphocytes. J. exp. Med. 136 (1972) 207.
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(15) Schafer, L. A., J. U. Guttermann, G. M. Mavligit, R. C. Reed, and E. M. Hersh: Permanent slide preparations of T lymphocyte - sheep red blood cell rosettes. J. Immunol. Meth. 8 (1975) 241.
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(17) West, W. H., R. B. Hermerman, Ch. W. Sienknecht, and A. S. Townes: Performance of a rosette assay between lymphocytes and sheep erythrocytes at celevated temperatures to study patiens with cancer and other discases. Clin. Immunol. Immunopathol. 5 (1976) 60.
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